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Ca++ Mg++-ATP 酶活性說明書
更新時間:2019-12-05 點擊量:2505

Ca++ Mg++-ATP 酶活性測定說明書

可見分光光度法

產(chǎn)品說明:

Ca++ Mg++-ATP 酶廣泛分布于植物、動物、微生物和細胞中,可催化ATP水解生成ADP和無機磷。根據(jù)Ca++ Mg++-ATP酶分解ATP生成ADP及無機磷,通過測定無機磷的量來確定ATP 酶活性高低。

需自備的儀器及用品:

可見分光光度計、水浴鍋、臺式離心機、可調(diào)式移液器、1mL 玻璃比色皿、研缽、冰和蒸餾水。

試劑的組成和配制:

提取液:液體50mL ×1 瓶,4℃保存。試劑一:液體 10mL×1 瓶,4℃保存。試劑二:液體 5mL×1 瓶,4℃保存。試劑三:液體 5ml×1 瓶,4℃保存。

試劑四:粉劑×3 支,-20℃保存。用時每支加1mL 蒸餾水,現(xiàn)用現(xiàn)配。用不完的試劑-20℃ 可保存一周。

試劑五:液體 5mL×1 瓶,4℃保存。

試劑六:粉劑×1 瓶,4℃保存。用時加入3mL 蒸餾水, 4℃保存。

試劑七:粉劑×1 瓶,4℃保存。用時加入25mL 蒸餾水,溶解后4℃保存一周。試劑八:粉劑×1 瓶,4℃保存。用時加入25mL 蒸餾水,溶解后4℃保存一周。試劑九:液體25mL×1 瓶,室溫保存。

試劑十:10mmol/L 標準磷貯備液 10mL×1 瓶,4℃保存。

0.5μmol/mL 標準磷應(yīng)用液配制:將試劑十20倍稀釋,即取 0.1mL試劑十加1.9mL蒸餾水充分混勻

定磷劑的配制:按H2O: 試劑七:試劑八:試劑九=2:1:1:1 的比例配制,配好的定磷劑應(yīng)為淺黃色。若無色則試劑失效,若是藍色則為磷污染,定磷劑現(xiàn)用現(xiàn)配。

注意:配試劑zui好用新的燒杯、玻棒和玻璃移液器,也可以用一次性塑料器皿,避免磷污染。

樣品酶液的制備:

1、 細菌、細胞或組織樣品的制備:

細菌或培養(yǎng)細胞:先收集細菌或細胞到離心管內(nèi),離心后棄上清;按照細菌或細胞數(shù)量(104 個):提取液體積(mL)為500~1000:1 的比例(建議500 萬細菌或細胞加入1mL 提取液), 超聲波破碎細菌或細胞冰浴,功率20%或200W,超聲3s,間隔10s,重復(fù)30 次);8000g 4℃ 離心10min,取上清,置冰上待測。

組織:按照組織質(zhì)量(g):提取液體積(mL)為1:5~10 的比例(建議稱取約0.1g 組織, 加入1mL 提取液),進行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min,取上清,置冰上待測。

2、 血清(漿)樣品:直接檢測。

 

操作步驟:

1、 分光光度計預(yù)熱30min 以上,調(diào)節(jié)波長至660nm,蒸餾水調(diào)零。

2、 酶促反應(yīng)(在 EP 管中加入下列試劑)

 

對照管

測定管

試劑一(μL)

130

90

試劑二(μL)

40

40

試劑三(μL)

40

40

試劑四(μL)

40

40

試劑五(μL)

 

40

樣本 (μL)

 

200

混勻,37℃(哺乳動物)或 25℃(其他物種)準確水浴 10min。

試劑六(μL)

50

50

樣本 (μL)

200

 

混勻,8000g,常溫離心 10min,取上清液

3、 定磷(1.5mLEP 管中依次加入下列試劑)

 

空白管

標準管

對照管

測定管

0.5μmol/ml 標準磷應(yīng)用液(μL)

 

100

 

 

上清液(μL)

 

 

100

100

蒸餾水(μL)

100

 

 

 

定磷試劑(μL)

1000

1000

1000

1000

混勻,室溫放置 30 min,在 660nm 處比色。

注意事項:

1、 由于每一個樣都必須做對照,本試劑盒50管只能測24份Ca++ Mg++-ATP 酶。

2、 此法具有微量、靈敏、快速的特點。所以對測定所用試管要求嚴格無磷。避免磷污染是檢測成敗的關(guān)鍵。

3、 空白管和標準管只要做一管。

計算

1、 血清(漿)Ca++ Mg++-ATPase 活力的計算:

定義:規(guī)定每小時每毫升血清(漿)中Ca++ Mg++- ATP酶分解ATP產(chǎn)生1μmol無機磷的量為一個酶活力單位。

Ca++ Mg++-ATP 酶活力(U/mL)=[ C 標準管×V 總]×(A 測定管-A 對照管)÷(A 標準管-A空白管)÷V 樣÷T=7.5×(A 測定管-A 對照管)÷(A 標準管-A 空白管)

2、 組織、細菌或細胞中Ca++ Mg++- ATPase 活力的計算:

(1) 按蛋白濃度計算:

定義:每小時每毫克組織蛋白中Ca++ Mg++- ATP酶分解ATP產(chǎn)生1μmol無機磷的量為一個酶活力單位。

ATP 酶活力(U/ mg)=[C 標準管×V 總]×(A 測定管-A 對照管)÷(A 標準管-A 空白管)

÷(V 樣×Cpr)÷T =7.5×(A 測定管-A 對照管)÷(A 標準管-A 空白管)÷Cpr

 

(2) 按樣本鮮重計算:

定義:每小時每克組織中Ca++ Mg++-ATP酶分解ATP產(chǎn)生1μmol無機磷的量為一個酶活力位。Ca++ Mg++-ATP 酶活力(U/g)= [C標準管×V總]×(A測定管-A對照管)÷(A標準管-A空

白管)÷(W× V 樣÷V樣總)÷T=7.5×(A測定管-A對照管)÷(A標準管-A空白管)÷W

(3) 按細菌或細胞密度計算:

定義:規(guī)定每小時每1萬個細菌或細胞中Ca++ Mg++-ATP 酶分解ATP產(chǎn)生1μmol無機磷的量為一個酶活力單位。

Ca++ Mg++-ATP 酶活力(U/104)= [C標準管×V總]×(A測定管-A對照管)÷(A標準管-A空白管)÷(500×V 樣÷V樣總)÷T=0.015×(A測定管-A 對照管)÷(A標準管-A空白管)

 

C 標準管:標準管濃度,0.5μmol/mL;V 總:酶促反應(yīng)總體積,0.5mL;V 樣:加入樣本體積,0.2mL ;V 樣總:加入提取液體積,1mL;T:反應(yīng)時間,1/6 小時;Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mL;W:樣本鮮重,g;500:細菌或細胞總數(shù),500 萬。

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